內容類型 應用注釋
相關機構：邁阿密癌症研究所，邁阿密，佛羅裡達州；貝克曼庫爾特生命科學，印第安納波利斯，印第安納州

目的

病毒核酸萃取是透過 RT-PCR 進行下游基因組分析的第一步。在此，我們介紹了一項邁阿密癌症研究所與 貝克曼庫爾特生命科學 的合作研究，使用 RNAdvance Viral 萃取試劑組使用說明書，從鼻咽拭子萃取病毒核酸的 RNAdvance Viral 研究試劑。我們展示了在 RT-PCR 工作流程中如何使用透過 RNAdvance Viral 試劑萃取的病毒 RNA。研究所提供數據包括該試劑的分析效能，以及透過與競爭品牌的萃取試劑組比較在基於通用樣品保存液 qRT-PCR 的 Ct 值方面得出的一致性數據。

工作流程概述

RNAdvance Viral 試劑是一種使用固相可逆固定法或 SPRI 技術來分離 RNA 的化學試劑。經證實，其可從低至 200μL 的樣本中萃取高純度的 RNA。人工萃取 24 份樣本的操作時間約為 1 小時。如需進行大量樣本的萃取，使用 Biomek i5 萃取液可 1.75 小時內用最少的人工操作完成兩盤培養盤的樣品（192 份樣品）。RNAdvance Viral 工作流程（圖 1）包括樣本溶解及結合-洗滌-洗脫步驟。

所提供數據由邁阿密癌症研究所獨立操作得出。

1. 分析效能預估 - 靈敏度

將 Exact Diagnostics SARS-CoV-2 標準陽性對照品（RUO，EDX，目錄號 COV019）和陰性對照品（EDX，目錄號 COV000）以 200、20、2 和 0.2 拷貝數/μL的 濃度加入陰性通用樣品保存液（HEALTHLINK，目錄號 330C.DHI）中。使用貝克曼庫爾特RNAdvance Viral 試劑或另一種使用磁珠的萃取試劑組（競品 A）手動萃取 RNA，使用 Integrated DNA Technologies (IDT) 2019-nCoV RUO 試劑組進行 qRT-PCR 檢測。

透過 qRT-PCR 使用針對 SARS-CoV-2 病毒核衣殼 蛋白N1、N2 和 N3 片段（N1、N2 和 N3）的研究引子評估 Ct 值，以檢測病毒 RNA；透過 qRT-PCR 使用 RNase P（RP）引子評估 Ct 值用於檢測人類 RNase P RNA。納入陽性對照品 2019-nCoV_N_Positive Control（IDT：10006625）和 qPCR 陰性對照品（NTC Ambion，目錄號 AM4932）以確保有合適的實驗對照。採用未經萃取的 Exact Diagnostics RNA 標準品（SARS-CoV-2 標準品）作為回收率對照。

數據顯示，RNAdvance Viral 試劑和競品 A 萃取試劑組的 Ct 值相當（表 1）。與 RNA 標準品（未經萃取的 SARS-CoV-2 標準品）相比，使用 RNAdvance Viral 試劑萃取 RNA 的 Ct 值較為穩定。RNAdvance Viral 試劑的回收率大於 95%，且無 PCR 抑制。在所有病毒效價下，透過引子 SARS-CoV-2 N1、SARS-CoV-2 N2 和 SARS-CoV-2 N3 的 RNAdvance Viral 的 Ct 值/RNA 標準品的 Ct 值計算回收率。

將分析性能定義為顯示有 PCR 擴增的病毒最低複製濃度。在兩次萃取過程中，0.2 拷貝數/μL 濃度的 Exact Diagnostics RNA 標準品均顯示 Ct 值未確定，表明其分析效能介於 0.2-2 拷貝數/μL 之間。

表 1. 萃取能力評估

2. 分析效能確認

為確認 RNAdvance Viral 試劑預估步驟中得出的分析效能數據（1 拷貝數/μL），從 Exact Diagnostics RNA 標準品中萃取 RNA，加入陰性通用樣品保存液中。所加入 RNA 標準品的濃度為 1 和 2 拷貝數/μL。每個濃度的標準品各製備四份樣品。

借助 CDC 2019 新型冠狀病毒 (2019-nCoV) RT-PCR 診斷套件說明書(CDC-006-00019) 中描述的有關檢測設置部分的操作方案，透過 qRT-PCR 對 Ct 值進行測定。每份樣品均進行 N1、N2、N3 和 RP 基因檢測。此外，納入 RUO 對照 2019-nCoV_N_陽性對照品（IDT：10006625）和 qPCR 陰性對照品（NTC Ambion，目錄號 AM4932）以確保有合適的實驗對照。

1 拷貝數/μL 和 2 拷貝數/μL 濃度的 RNA 標準品顯示出相當的 Ct 值（表 2），證實了 1 拷貝數/μL 即為 RNAdvance Viral 試劑的分析效能數值。

表 2. RNAdvance Viral 試劑分析效能確定

3. 樣品一致性

透過與競品 A 萃取並檢測過的 RNA 樣品的 Ct 值進行比較，驗證了樣品的一致性。已知陽性樣品有 24 個，其 Ct 值 <40；SARS-CoV-2 陰性樣品（表 3）23 個。所有樣品均用 COPAN 鼻咽拭子採集，萃取前保存在 HEALTHLINK 通用樣品保存液中。使用 RNAdvance Viral 試劑人工萃取所有樣品 RNA。使用 N2 和 RP 引子/探針組進行 RT-PCR 測定。納入 2019-nCoV_N_陽性對照品（IDT：10006625）和 qPCR 陰性對照品（NTC Ambion，目錄號 AM4932）以確保有合適的實驗對照。

所有陽性樣品數據的一致性為 100%。但是 23 個先前測定為陰性的樣品中，有 1 個轉為陽性，表明一致性為 96%。操作人員指出此為樣品處理環節的一個失誤。

表 3. 已知陽性和陰性 SARS-CoV-2 樣品的 Ct 值和效能比較

結論

本研究針對一項用於實驗研究的病毒萃取方案做出了評估，該方案可從儲存在通用樣品保存液裡的鼻音拭子樣本中有效分離病毒 RNA。研究表明 RNAdvance Viral 萃取效率大於 95%，且不會對下游的 qRT-PCR 分析產生抑制作用。分析效能是低至 1 拷貝數/μL 濃度的病毒 RNA 萃取。與已知陽性樣品和陰性樣品所得檢測結果的一致性分別為 100% 和 96%，與競品試劑組萃取的 NA Ct 值相比，準確率約為 98%。該評估所得數據表明 RNAdvance Viral 試劑能夠在通用樣品保存液裡從鼻音拭子樣本中萃取病毒 RNA。

產品訊息：病毒 RNA 萃取試劑組

RNAdvance Viral XP 被列為一種萃取方法，用於疾病控制中心的 EUA 授權的 COVID-19 檢測（參考 FDA 關於 SARS-CoV-2 檢測的常見問題解答）。除此指定用途外，RNAdvanced Viral XP 僅供研究使用，不用於診斷目的。
RNAdvance Viral 用於學術研究。

相關線上講座

敬請觀看 Beckman Coulter Life Sciences 與 Integrated DNA Technologies (IDT) 的合作成果，該成果以病毒 RNA萃取試劑組為特色，可用於 qPCR 樣本的製備。

¹Qi Wei, Ph.D.; ¹Weiming Shen, MS, ASCP^CM; ¹Haixue Gan; ¹Dianelis Mondejar Alvarez; ¹Mendizabal; ¹Tania E. Pumariega; ²Cindy Heath; ²Han Wei, Ph.D.
關聯機構：¹邁阿密癌症研究所，邁阿密，佛羅裡達州；²貝克曼庫爾特生命科學 ，印第安納波利斯，印第安納州

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